摘 要

技术是干细胞注射液及制备方法。所述注射液由肝干细胞、脐带间充质干细胞、聚乙二醇、精氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、冰醋酸、胶原蛋白、糖胺聚糖、维甲酸和乙醇胺按照一定的分量比组成。本发明所述的肝干细胞注射液中，肝干细胞和脐带间充质干细胞相配合，对糖尿病治疗效果更佳；本发明所述的注射液配方可以长时间维持肝干细胞活性，且无任何毒副成分，安全有效，成本低廉，可直接应用与糖尿病临床注射。使用本发明所述的肝干细胞培养方法及其专用培养基，能有效维持肝干细胞的最佳状态，引导细胞增殖，同时保持肝干细胞的干性，且降低培养和收获过程中肝干细胞的损伤率和死亡率，缩短生长周期。

背景技术

在20世纪早期，有学者通过一些实验现象推测成熟的肝脏具有很强的再生能力,因为其中存在着一群可分化为肝细胞和胆管细胞的“祖先”细胞。目前人们对肝干细胞的存在已形成广泛共识，它是一种具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，可以通过自身对称性和不对称性分裂产生表现型和基因型与自身完全相同的干细胞，也能产生肝脏组织中不同发育阶段和不同分化方向的细胞，如肝细胞、胆管上皮细胞和胰腺上皮细胞等。随着对其特性的深入了解，它将代替肝细胞移植和肝脏移植成为治疗器官衰竭的一种重要细胞来源，在肝细胞移植、体外人工肝、基因治疗方面均有着巨大的潜力，目前现有技术中已有利用流产胎儿的肝脏组织培养肝脏干细胞用于治疗糖尿病的先例，病取得了良好的疗效。

由肝干细胞制备的干细胞注射液在临床上可以用于治疗肝硬化或糖尿病等。然而与普通生物制品和药品不同，干细胞注射液的活性物质是细胞，细胞在离体环境中，活性会迅速下降，传统方法用含人血白蛋白的氯化钠注射液对肝干细胞进行保存，在8-24h以内，细胞活性即大幅下降，无法长期保证细胞活性，例如中国专利CN102948413B中公开的肝干细胞保存液，主要由人血白蛋白、氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾、氯化镁和肝素钙组成，将肝干细胞重悬于所述保存液中即形成注射液，细胞保存能力较差。大量研究发现，用含有胎牛血清或细胞培养基的保存液可以解决细胞活性下降的问题，但是细胞接触胎牛血清时会内吞胎牛血清，进而引起细胞某些蛋白表达特性的变化，细胞回输人体后可能引起过敏反应，且血清中含有大量未知成分，不能临床使用。

目前，肝脏干细胞的分离、培养及扩增研究尚处于起步阶段，有关肝细胞的体外扩增及肝干细胞系的建设仍然是研究的重点。由于肝干细胞表面缺乏特异性标志，给肝干细胞的分离和鉴定带来一定的困难，因为分离纯化技术目前很不成熟，使得肝脏干细胞通过分离技术得到的数量很低，所以体外培养及扩增很重要。但肝脏干细胞体外培养时生长缓慢且很容易为成熟肝细胞而失去增殖能力，故肝干细胞的系的建立仍然是目前研究工作的难点及重点。肝干细胞是维持自我复制还是分化为成熟的功能细胞依赖于微环境、细胞生长因子、基质细胞、细胞外基质等多种因素的相互作用与平衡，虽然人们对肝干细胞的研究作出了巨大的努力，如中国专利申请CN104630135A公开的“大规模制备肝干细胞的方法与用途”，提供了肝干细胞体外扩增的一种方法；中国专利CN101851605B中公开了一种肝干细胞的选择培养基，由液体基础培养基内加胎牛血清、人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素组成，并公开了一种选择性分离并扩增肝干细胞的方法；中国专利申请CN104818245A中公开的一种肝干细胞培养基，包括基础培养基、HGF、SCF和LIF，以及应用该培养基培养肝干细胞的方法。但至今尚未建立安全可靠、功能完全和永生化的人肝干细胞系。

技术特征在于在前人研究的基础上，提供了一种肝干细胞注射液，能够长时间维持肝干细胞的活性，以及肝干细胞体外培养方法及专用培养基，达到抑制分化，同时给予适当的营养位置及生长因子以促进增殖的目的。